Un nuevo Coronavirus de pacientes con neumonía en China, 2019

Na Zhu, Ph.D., Dingyu Zhang,Ph.D., Wenling Wang, Ph.D., Xingwang Li, Ph.D., Bo Yang, Ph.D., Jingdong Song, Ph.D., Xiang Zhao, Ph.D., Baoying Huang, Ph.D., Weifeng Shi, Ph.D., Roujian Lu, M.D., Peihua Niu, Ph.D., Faxian Zhan, Ph.D., y otros, para el Equipo de Investigación y Estudio del Coronavirus de China

Resumen

En diciembre de 2019, un grupo de pacientes con neumonía de causa desconocida fue vinculado a un mercado mayorista de mariscos en Wuhan (China). Se descubrió un betacoronavirus previamente desconocido mediante el uso de una secuenciación no sesgada en muestras de pacientes con neumonía. Se utilizaron células epiteliales de las vías respiratorias humanas para aislar un nuevo coronavirus, denominado 2019-nCoV, que formó un clado dentro del subgénero sarbecovirus, la subfamilia Orthocoronavirinae. A diferencia del MERS-CoV y el SARS-CoV, 2019-nCoV es el séptimo miembro de la familia de coronavirus que infectan a los humanos. Se está llevando a cabo una mayor vigilancia y una investigación más profunda. (Financiado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China y el Proyecto Nacional Mayor para el Control y la Prevención de Enfermedades Infecciosas en China).

Los patógenos emergentes y reemergentes son desafíos mundiales para la salud pública1 . Los coronavirus son virus de ARN envueltos que se distribuyen ampliamente entre los seres humanos, otros mamíferos y las aves y que causan enfermedades respiratorias, entéricas, hepáticas y neurológicas2,3 . Cuatro virus – 229E, OC43, NL63, y HKU1 – son prevalentes y típicamente causan síntomas de resfriado común en individuos inmunocompetentes.4 Las otras dos cepas – el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio del Medio Oriente (MERS-CoV) – son de origen zoonótico y se han vinculado a enfermedades a veces fatales.5 El VSC-RAS fue el agente causal de los brotes de síndrome respiratorio agudo severo en 2002 y 2003 en la provincia de Guangdong (China).6-8 El VMS-CoV fue el patógeno responsable de los brotes de enfermedades respiratorias severas en 2012 en el Oriente Medio.9 Habida cuenta de la alta prevalencia y la amplia distribución de los coronavirus, la gran diversidad genética y la frecuente recombinación de sus genomas, así como las crecientes actividades de interfaz entre el hombre y el animal, es probable que periódicamente surjan nuevos coronavirus en los seres humanos debido a las frecuentes infecciones entre especies y a los ocasionales efectos secundarios5,10 .

A fines de diciembre de 2019, varios establecimientos sanitarios locales informaron de la existencia de grupos de pacientes con neumonía de causa desconocida que estaban vinculados epidemiológicamente a un mercado mayorista de mariscos y animales húmedos en Wuhan, provincia de Hubei (China)11 . Informamos de los resultados de esta investigación, identificando la fuente de los grupos de neumonía, y describimos un nuevo coronavirus detectado en pacientes con neumonía cuyas muestras fueron analizadas por el CDC de China en una fase temprana del brote. También describimos las características clínicas de la neumonía en dos de estos pacientes.

Métodos

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO VIRAL

Se recogieron cuatro muestras de las vías respiratorias inferiores, incluido el líquido de lavado broncoalveolar, de pacientes con neumonía de causa desconocida que fueron identificados en Wuhan el 21 de diciembre de 2019, o posteriormente, y que habían estado presentes en el Mercado de Mariscos de Huanan cerca del momento de su presentación clínica. Se recogieron siete muestras de líquido de salvamento broncoalveolar de pacientes de hospitales de Beijing con neumonía de causa conocida para que sirvieran como muestras de control. La extracción de ácidos nucleicos de las muestras clínicas (incluidos los cultivos no infectados que sirvieron como controles negativos) se realizó con un kit de ácidos nucleicos virales de alta pureza, según lo descrito por el fabricante (Roche). Las muestras de ácido nucleico extraídas se analizaron para detectar virus y bacterias mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando el RespiFinderSmart22kit (PathoFinder BV) y el sistema de PCR en tiempo real LightCycler 480, de conformidad con las instrucciones del fabricante12 . Además, se utilizó una secuenciación imparcial de alto rendimiento, descrita anteriormente13 , para descubrir secuencias microbianas no identificables por los medios descritos anteriormente. Se utilizó un ensayo de PCR de transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) para detectar el ARN vírico mediante la selección de una región de consenso RdRp de pan β-CoV, como se describe en el apéndice suplementario.

AISLAMIENTO DEL VIRUS

Se recogieron muestras de líquido de la savia broncoalveolar en vasos estériles a los que se añadió un medio de transporte de virus. Las muestras se centrifugaron para eliminar los restos celulares. El sobrenadante se inoculó en células epiteliales de las vías respiratorias humanas13 , que se habían obtenido de muestras de vías respiratorias resecadas de pacientes sometidos a cirugía de cáncer de pulmón y se confirmó que estaban libres de patógenos especiales por el NGS14.

Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se expandieron sobre un sustrato de plástico para generar células de pasaje-1 y posteriormente se colocaron a una densidad de 2,5×105 células por pozo en soportes permeables Transwell-COL (12 mm de diámetro). Se generaron cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas en una interfaz aire-líquido durante 4 a 6 semanas para formar cultivos bien diferenciados y polarizados que se asemejan al epitelio mucociliar pseudoestratificado in vivo13.

Antes de la infección, las superficies apicales de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato; se inoculó a la superficie apical de los cultivos celulares 150 μl de sobrenadante procedente de muestras de líquido de salvamento broncoalveolar. Tras una incubación de dos horas a 37ºC, se eliminó el virus no ligado lavándolo con 500 μl de solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos; las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se mantuvieron en una interfaz aire-líquido incubada a 37ºC con un 5% de dióxido de carbono. Cada 48 horas, se aplicaron 150 μl de solución salina tamponada con fosfato a las superficies apicales de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas, y después de 10 minutos de incubación a 37°C se recogieron las muestras. Las células epiteliales mucociliares pseudoestratificadas se mantuvieron en este ambiente; las muestras apicales se pasaron en un vial diluido a 1:3 a las nuevas células. Las células se controlaban diariamente con microscopía de luz, para detectar efectos citopáticos, y con RT-PCR, para detectar la presencia de ácido nucleico viral en el sobrenadante. Después de tres pasajes, se prepararon muestras apicales y células epiteliales de las vías respiratorias humanas para la microscopía electrónica de transmisión.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

Se recogieron sobrenadantes de cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas que mostraron efectos citopáticos, se inactivaron con paraformaldehído al 2% durante al menos 2 horas y se ultracentrifugaron para sedimentar partículas de virus. El sobrenadante enriquecido fue teñido negativamente en rejillas recubiertas de película para su examen. Las células epiteliales de las vías respiratorias humanas que mostraban efectos citopáticos se recogieron y fijaron con paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2,5% y luego se fijaron con tetraóxido de osmio al 1% deshidratado con etanol de grado incrustado con resina PON812. Se cortaron secciones (80 nm) del bloque de resina y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo, por separado. Las rejillas teñidas en negativo y las secciones ultrafinas se observaron bajo microscopía electrónica de transmisión.

SECUENCIACIÓN DEL GENOMA VIRAL

El ARN extraído del líquido de la esclavitud broncoalveolar y de los sobrenadantes de cultivo se utilizó como plantilla para clonar y secuenciar el genoma. Utilizamos una combinación de secuenciación Illumina y secuenciación de nanoporos para caracterizar el genoma del virus. Las lecturas de secuencias se ensamblaron en mapas contiguos (un conjunto de segmentos de ADN superpuestos) con el uso del software CLC Genomics, versión 4.6.1 (CLC Bio). Posteriormente se diseñaron cebadores específicos para la PCR, y se utilizó 5′- o 3′-RACE (amplificación rápida de los extremos del ADNc) para llenar las lagunas del genoma de la secuenciación convencional de Sanger. Estos productos para la PCR se purificaron de geles y se secuenciaron con un kit de secuenciación de ciclos BigDye Terminator v3.1 y un analizador genético 3130XL, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

La alineación de secuencias múltiples de las secuencias 2019-nCoV y de referencia se realizó con el uso de Muscle. El análisis filogenético de los genomas completos se realizó con RAxML (13) con 1000 réplicas de bootstrap y un modelo general reversible en el tiempo utilizado como modelo de sustitución de nucleótidos.

Se muestran las radiografías de tórax del Paciente 2 en los días 8 y 11 después de la aparición de la enfermedad. La tráquea fue intubada y la ventilación mecánica instituida en el período entre la adquisición de las dos imágenes. Las opacidades esponjosas bilaterales están presentes en ambas imágenes pero están aumentadas en densidad, profusión y confluencia en la segunda imagen; estos cambios son más marcados en los campos pulmonares inferiores. Los cambios consistentes con la acumulación de líquido pleural también son visibles en la segunda imagen.

Resultados

PACIENTES

Tres pacientes adultos presentaron una neumonía grave y fueron admitidos en un hospital de Wuhan el 27 de diciembre de 2019. El paciente 1 era una mujer de 49 años, el paciente 2 era un hombre de 61 años y el paciente 3 era un hombre de 32 años. Se disponía de perfiles clínicos de los Pacientes 1 y 2. El Paciente 1 informó que no tenía ninguna condición médica crónica subyacente pero informó de fiebre (temperatura, 37°C a 38°C) y tos con molestias en el pecho el 23 de diciembre de 2019. Cuatro días después de la aparición de la enfermedad, su tos y molestias en el pecho empeoraron, pero la fiebre se redujo; el diagnóstico de neumonía se basó en una tomografía computarizada (TC). Su ocupación era minorista en el mercado mayorista de mariscos. El paciente 2 informó inicialmente de fiebre y tos el 20 de diciembre de 2019; el malestar respiratorio se desarrolló 7 días después de la aparición de la enfermedad y empeoró en los dos días siguientes (véanse las radiografías de tórax, figura 1), momento en el que se inició la ventilación mecánica. Había sido un visitante frecuente del mercado mayorista de mariscos. Los pacientes 1 y 3 se recuperaron y fueron dados de alta del hospital el 16 de enero de 2020. El paciente 2 murió el 9 de enero de 2020. No se obtuvieron muestras de biopsia.

DETECCIÓN Y AISLAMIENTO DE UN NUEVO CORONAVIRUS

Tres muestras de tejido broncoalveolar fueron recogidas en el Hospital Wuhan Jinyintan el 30 de diciembre de 2019. No se detectaron patógenos específicos (incluyendo HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-OC43, y HCoV-HKU1) en las muestras clínicas de estos pacientes por el RespiFinderSmart22kit. El ARN extraído del fluido de los vasos broncoalveolares de los pacientes se utilizó como plantilla para clonar y secuenciar un genoma utilizando una combinación de secuenciación de Illumina y secuenciación de nanoporos. Se obtuvieron más de 20.000 lecturas virales de especímenes individuales, y la mayoría de los contiguos coincidieron con el genoma del linaje B del género betacoronavirus – mostrando más del 85% de identidad con un genoma CoV similar al del SARS de murciélago (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1) publicado previamente. También se obtuvieron resultados positivos con el uso de un ensayo de RT-PCR en tiempo real para el ARN dirigido a una región de consenso RdRp de pan β-CoV (aunque el valor de umbral del ciclo fue superior a 34 para las muestras detectadas). El aislamiento del virus de las muestras clínicas se realizó con células epiteliales de las vías respiratorias humanas y líneas celulares Vero E6 y Huh-7. El virus aislado se denominó 2019-nCoV.

Figura 2. Efectos citopáticos en cultivos de células epiteliales de vías respiratorias humanas después de la inoculación con 2019-nCoV.

Para determinar si las partículas de virus podían ser visualizadas en 2019-nCoV-células epiteliales de vías respiratorias humanas infectadas, se examinaron cultivos epiteliales de vías respiratorias humanas simuladas y 2019-nCoV-infectadas con microscopía de luz diariamente y con microscopía electrónica de transmisión 6 días después de la inoculación. Se observaron efectos citopáticos 96 horas después de la inoculación en las capas superficiales de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas; se observó una falta de latido del cilio con la microscopía de luz en el centro del foco (Figura 2). No se observaron efectos citopáticos específicos en las líneas celulares Vero E6 y Huh-7 hasta 6 días después de la inoculación.

Las micrografías electrónicas de las partículas de 2019-nCoV teñidas negativamente eran generalmente esféricas con cierto pleomorfismo (Figura 3). El diámetro varió desde unos 60 a 140 nm. Las partículas de virus tenían picos bastante distintivos, de unos 9 a 12 nm, y daban a los viriones la apariencia de una corona solar. En las secciones ultrafinas del epitelio de las vías respiratorias humanas se encontraron partículas de virus libres de extracelulares y cuerpos de inclusión llenos de partículas de virus en vesículas unidas por membranas en el citoplasma. Esta morfología observada es consistente con la familia Coronaviridae.

Para caracterizar aún más el virus, se obtuvieron secuencias de novo del genoma 2019-nCoV a partir de muestras clínicas (líquido de lavado broncoalveolar) y aislamientos de virus de células epiteliales de las vías respiratorias humanas mediante la secuenciación de Illumina y nanoporos. El nuevo coronavirus fue identificado en los tres pacientes. Se obtuvieron dos secuencias de coronavirus casi completas del líquido de unión broncoalveolar (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2020|EPI_ISL_402121), y una secuencia completa de un virus aislado de un paciente (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2020|EPI_ISL_402119). Las secuencias completas del genoma de los tres nuevos coronavirus se presentaron al GISAID (BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019, accession ID: EPI_ISL_402119; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, ID de adhesión: EPI_ISL_402120; BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019, número de identificación de la adhesión: EPI_ISL_402121) y tienen una identidad de secuencia de nucleótidos del 86,9% a un genoma de CoV similar al SARS de murciélago (bat-SL-CoVZC45, MG772933.1) publicado anteriormente. Los tres genomas de 2019-nCoV se agruparon dentro del subgénero del sarbecovirus, que muestra la organización típica del betacoronavirus: una región no traducida (UTR) 5′, un complejo de replicasa (orf1ab), un gen S, un gen E, un gen M, un gen N, un UTR 3′, y varios marcos de lectura abiertos no identificados.

Figura 3. Visualización de 2019-nCoV con Microscopía Electrónica de Transmisión.
Las partículas de 2019-nCoV teñidas de negativo se muestran en el Panel A, y las partículas de 2019-nCoV en las secciones ultrafinas de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas se muestran en el Panel B. Las flechas indican partículas de virus extracelulares, las flechas indican cuerpos de inclusión formados por componentes de virus, y los triángulos indican los cilios.

Aunque el 2019-nCoV es similar a algunos betacoronavirus detectados en murciélagos (Figura 4), es distinto del SARS-CoV y el MERS-CoV. Los tres 2019-nCoV coronavirus de Wuhan, junto con dos cepas similares al SARS derivadas de murciélagos, ZC45 y ZXC21, forman un clado distinto. Las cepas del SARS-CoV de los humanos y los coronavirus genéticamente similares al SARS de los murciélagos recolectados en el suroeste de China formaron otro clado dentro del subgénero sarbecovirus. Dado que la identidad de la secuencia en los dominios de la replicasa conservada (ORF 1ab) es inferior al 90% entre 2019-nCoV y otros miembros del betacoronavirus, el 2019-nCoV -el probable agente causante de la neumonía vírica en Wuhan- es un nuevo betacoronavirus que pertenece al subgénero sarbecovirus de la familia Coronaviridae.

Figura 4. Esquema de 2019-nCoV y análisis filogenético de 2019-nCoV y otros genomas de Betacoronavirus.
Se muestra un esquema de 2019-nCoV (Panel A) y un análisis filogenético completo de 2019-nCoV y otros genomas de betacoronavirus en la subfamilia Orthocoronavirinae (Panel B).

Discusión

Reportamos un novedoso CoV (2019-nCoV) que fue identificado en pacientes hospitalizados en Wuhan, China, en diciembre de 2019 y enero de 2020. La evidencia de la presencia de este virus incluye la identificación en el fluido de los eslabones broncoalveolares en tres pacientes por medio de la secuenciación del genoma completo, la PCR directa y el cultivo. La enfermedad que probablemente fue causada por este CoV fue llamada «neumonía infectada por un nuevo coronavirus» (NCIP). Los genomas completos fueron sometidos a la GISAID. El análisis filogenético reveló que 2019-nCoV cae dentro del género betacoronavirus, que incluye coronavirus (SARS-CoV, CoV similar al SARS de murciélagos y otros) descubiertos en humanos, murciélagos y otros animales salvajes15 .

Las técnicas moleculares se han utilizado con éxito para identificar agentes infecciosos durante muchos años. La secuenciación imparcial y de alto rendimiento es una herramienta poderosa para el descubrimiento de patógenos14,16. La secuenciación y la bioinformática de nueva generación están cambiando la forma en que podemos responder a los brotes de enfermedades infecciosas, mejorando nuestra comprensión de la aparición y transmisión de enfermedades, acelerando la identificación de patógenos y promoviendo el intercambio de datos. En este informe describimos el uso de técnicas moleculares y de secuenciación imparcial del ADN para descubrir un nuevo betacoronavirus que probablemente haya sido la causa de la neumonía grave en tres pacientes de Wuhan (China).

Aunque establecer cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas es una labor intensiva, parecen ser una valiosa herramienta de investigación para el análisis de los patógenos respiratorios humanos13 . Nuestro estudio demostró que la propagación inicial de las secreciones respiratorias humanas en cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias humanas, seguida de la microscopía electrónica de transmisión y la secuenciación del genoma completo del sobrenadante del cultivo, se utilizó con éxito para la visualización y detección de nuevos coronavirus humanos que posiblemente puedan eludir la identificación mediante los métodos tradicionales.

Todavía es necesario seguir desarrollando métodos precisos y rápidos para identificar patógenos respiratorios desconocidos. Sobre la base del análisis de tres genomas completos obtenidos en este estudio, se diseñaron varios ensayos específicos y sensibles dirigidos a las regiones ORF1ab, N y E del genoma 2019-nCoV para detectar ARN viral en muestras clínicas. Los conjuntos de cebadores y los procedimientos operativos estándar se han compartido con la Organización Mundial de la Salud y están destinados a la vigilancia y detección de la infección por el 2019-nCoV a nivel mundial y en China. Datos más recientes muestran la detección de 2019-nCoV en 830 personas en China17 .

Aunque nuestro estudio no cumple con los postulados de Koch, nuestros análisis proveen evidencia que implica 2019-nCoV en el brote de Wuhan. Evidencias adicionales para confirmar la importancia etiológica del 2019-nCoV en el brote de Wuhan incluyen la identificación de un antígeno 2019-nCoV en el tejido pulmonar de los pacientes por medio de análisis inmunohistoquímicos, la detección de anticuerpos antivirales IgM e IgG en las muestras de suero de un paciente en dos puntos de tiempo para demostrar la seroconversión, y experimentos con animales (monos) para proporcionar evidencia de patogenicidad. De importancia crítica son las investigaciones epidemiológicas para caracterizar los modos de transmisión, el intervalo de reproducción y el espectro clínico resultante de la infección para informar y perfeccionar las estrategias que pueden prevenir, controlar y detener la propagación del 2019-nCoV.

Esta labor fue apoyada por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2016YFD0500301) y el Proyecto Nacional Principal para el Control y la Prevención de las Enfermedades Infecciosas en China (2018ZX10101002).

Los formularios de divulgación proporcionados por los autores están disponibles con el texto completo de este artículo en NEJM.org.

Los doctores Zhu, Zhang, W. Wang, Li y Yang contribuyeron igualmente a este artículo.

Este artículo fue publicado el 24 de enero de 2020, y actualizado el 29 de enero de 2020, en NEJM.org.

Agradecemos a la Dra. Zhongjie Li, al Dr. Guangxue He, al Dr. Lance Rodewald, a Yu Li, a Fei Ye, a Li Zhao, a Weimin Zhou, a Jun Liu, a Yao Meng, a Huijuan Wang, y a muchos miembros del personal del CDC de China por sus contribuciones y ayuda en esta preparación y presentación de una versión anterior del manuscrito.

Afiliaciones de los autores

Del Laboratorio Clave de Bioseguridad del NHC, Instituto Nacional para el Control y la Prevención de Enfermedades Virales, Centro Chino para el Control y la Prevención de Enfermedades (N.Z., W.W., J.S., X.Z., B.H., R.L., P.N., X.M., D.W., W.X., G.W., G.F.G., W.T.), y el Departamento de Enfermedades Infecciosas del Hospital Ditan de Beijing, Universidad Médica de la Capital (X.L.) – ambos en Beijing; el Hospital Wuhan Jinyintan (D.Z.), la División de Detección de Enfermedades Virales del Centro Provincial de Hubei para el Control y la Prevención de Enfermedades (B.Y., F.Z.), y el Centro de Mega-Ciencia de Bioseguridad, Academia China de Ciencias (W.T.) – todos en Wuhan; y la Primera Universidad Médica de Shandong y la Academia de Ciencias Médicas de Shandong, Jinan, China (W.S.).

Dirija las solicitudes de reimpresión al Dr. Tan al Laboratorio Clave de Bioseguridad del NHC, Instituto Nacional para el Control y la Prevención de Enfermedades Virales, China CDC, 155 Changbai Road, Distrito de Changping, Beijing 102206, China; o a tanwj@ivdc.chinacdc.cn, Dr. Gao en el Instituto Nacional para el Control y la Prevención de Enfermedades Virales, China CDC, Beijing 102206, China, o en gaof@im.ac.cn, o el Dr. Wu en el Laboratorio Clave de Bioseguridad del NHC, Instituto Nacional para el Control y la Prevención de Enfermedades Virales, China CDC, Beijing 102206, China, o en wugz@ivdc.chinacdc.cn.


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